Определение аналитической чувствительности и специфичности методов ПЦР для диагностики черной бактериальной пятнистости томата

Статья посвящена молекулярно-генетическим методам диагностики возбудителей черной бактериальной пятнистости томата – вредоносного бактериального заболевания томата и перца, распространенного преимущественно в открытом грунте в южных регионах. Исследования проведены на базе Всероссийского центра карантина растений (ФГБУ «ВНИИКР») в 2022–2023 гг. В задачи работы входило определение аналитической чувствительности и специфичности молекулярно-генетических методов выявления и идентификации трех видов разных патологических типов бактерий рода Xanthomonas – возбудителей черной бактериальной пятнистости томата. Ввиду необходимости импортозамещения дорогостоящих реагентов испытания проводили с отечественными реактивами производства фирм ООО «Евроген» и ЗАО «Диалат». Приведены результаты эффективности ПЦР «в реальном времени» (ПЦР-РВ), анализ которых показал, что все тестируемые праймерные системы можно рекомендовать для выявления возбудителей бактериоза. При этом установлено, что ПЦР-РВ AFLP derived Taqman PCR и XopD Taqman PCR обладают высокой аналитической чувствительностью (10²–10³ КОЕ/мл). Показано, что 3 из 4 праймерных систем в соответствии с методикой Koenraadt et al. (2009) также обладают высоким уровнем чувствительности –10² КОЕ/мл. Аналитическая чувствительность праймеров Bs-XpF/R для выявления X. euvesicatoria pv. perforans составила 10⁴ КОЕ/мл, что достаточно для образцов с высокой концентрацией патогена и для идентификации чистой культуры бактерий. Все праймеры обладают 100%-ной специфичностью по отношению к целевым штаммам патогенов. Перекрестные реакции с другими штаммами не отмечены. Предлагаемая достоверная оперативная методика выявления возбудителей черной бактериальной пятнистости в семенах томата и перца в значительной степени снизит потери урожая и повысит экономическую эффективность производства отечественных овощей.

1. Oliveira-Pinto P.R., Mariz-Ponte N., Sousa R.M.O., Torres A., Tavares F., Ribeiro A., Santos C. Satureja montana essential oil, zein nanoparticles and their combination as a biocontrol strategy to reduce bacterial spot disease on tomato plants // Horticulturae. – 2021. – № 7 (12). – Pр. 1–22.

2. FAO. World Food and Agriculture – Statistical Yearbook. FAO: Rome, Italy, 2024.

3. Мотамеди Ш.А., Джалилов Ф.С.У. Влияние биопестицидов и индукторов устойчивости на развитие бактериальных болезней томата // Известия ТСХА. – 2011. – № 5. – С. 85–92.

4. Писарева И.Н., Яремко А.Б., Приходько С.И., Шнейдер Е.Ю. Испытание тест-системы для диагностики Xanthomonas euvesicatoria pv. euvesicatoria // Фитосанитария. Карантин растений. – 2022. – № 3 (11). – С. 29–36.

5. EPPO. Xanthomonas spp. (Xanthomonas euvesicatoria, Xanthomonas gardneri, Xanthomonas perforans, Xanthomonas vesicatoria) causing bacterial spot of tomato and sweet pepper / Bull. OEPP. – 2013. – № 43 (1). – Pр. 7–20.

6. Jones J.B., Bouzar H., Stall R.E., Almira E.C., Roberts P., Bowen B.W., Sudberry J., Strickler P., Chun J. Systematic analysis of Хanthomonads (Xanthomonas spp.) associated with pepper and tomato lesions // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. – 2000. – № 50 (3). – Pр. 1211–1219.

7. Vauterin L., Hoste B., Kersters K., Swings J. Reclassification of Xanthomonas // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. – 1995. – № 45 (3). – Pр. 472–489.

8. Jones J.B., Lacy G.H., Bouzar H., Stall R.E., Schaad N.W. Reclassification of the Xanthomonads associated with bacterial spot disease of tomato and pepper // Systematic Applied Microbiology. – 2004. – № 27 (6). – Pp. 755–762.

9. Bull C.T., De Boer S.H., Denny T.P., Firrao G., Fischer-Le Saux M., Saddler G.S., Scortichini M., Stead D.E., Takikawa Y. Comprehensive list of names of plant pathogenic bacteria, 1980–2007 // Journal of Plant Pathology. – 2010. – № 92 (3). – Pр. 551–592.

10. Ахатов А.К. Мир томата глазами фитопатолога. – 3-е изд., испр. и доп. – М.: Товарищество научных изданий КМК, 2016. – 292 с.

11. Иванцова Е.А. Болезни томата в Нижневолжском регионе // Фермер Поволжья. – 2017. – № 2 (55). – С. 80–82.

12. Мотамеди Ш.А., Джалилов Ф.С.У., Карлов Г.И. Оценка активности бактерицидов с использованием генетически модифицированного штамма возбудителя черной бактериальной пятнистости томата // Известия ТСХА. – 2010. – № 2. – С. 52–58.

13. Fatmi M., Walcott R.R., Schaad N.V. Detection of Plant-Pathogenic Bacteria in Seed and Other Planting Material, Second Edition. – Minnesota: The American Phytopathological Society (APS), 2017. – 360 p.

14. ISF (2017) Method for the detection of Xanthomonas spp. in Tomato seed. – [Электронный ресурс]. – URL: https://seedhealth.org/files/2017/05/Pepper_Xanthomonas_spp_Version-5-Nov_2013-ISF.pdf.

15. EPPO. Xanthomonas spp. (Xanthomonas euvesicatoria pv. euvesicatoria, Xanthomonas hortorum pv. gardneri, Xanthomonas euvesicatoria pv. perforans, Xanthomonas vesicatoria) causing bacterial spot of tomato and sweet pepper // Bull. OEPP. – 2023. – № 53. – Pр. 558–579.

16. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др. ПЦР «в реальном времени». – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. – 215 с.

17. Приходько С.И., Писарева И.Н., Корнев К.П. Оценка применимости молекулярных методов диагностики возбудителя бактериоза винограда (болезнь Пирса) Xylella fastidiosa Wells et al., используемых в международной и отечественной практике // Садоводство и виноградарство. – 2022. – № 1. – С. 38–43.

18. Тараканов Р.И., Игнатьева И.М., Белошапкина О.О., Чебаненко С.И., Каратаева О.Г., Джалилов Ф.С. Выявление возбудителя бактериального ожога сои Pseudomonas savastanoi pv. glycinea в семенах методом ПЦР // Известия ТСХА. – 2024. – № 1. – С. 41–52.