Применение новых методов выявления и идентификации Acidovorax Citrulli и оптимизация схемы лабораторной диагностики

Фитопатогенная бактерия Acidovorax citrulli входит в карантинные перечни многих стран мира, в том числе в Единый перечень карантинных объектов Евразийского экономического союза. Контроль проникновения и распространения карантинного организма на территорию России осуществляется, в том числе, путем проведения лабораторной диагностики. Диагностические методы должны обеспечивать не только качество, но и высокую скорость проведения тестирования здоровья продукции. Целью исследований стало применение новых методов выявления и идентификации A. citrulli, а также оптимизация схемы лабораторной диагностики. В ходе работы подготавливали и тестировали семена огурца с инфекционной нагрузкой. Тестирование проводили согласно оптимизированной диагностической схеме с применением не использовавшихся ранее в диагностике A. citrulli методов. На каждом этапе работы с образцами проводили учет затрачиваемого времени. Тестирование подготовленных зараженных семян на первом этапе проводили стандартным отборочным методом, а затем - ранее не применявшимся в диагностике A. citrulli методом ПЦР-РВ PAS F/R, PAS P Новый тест ПЦР-РВ PAS F/R, PAS P показал стабильные результаты при тестировании каждого образца в ряду каждой повторности. Успешно применен ранее не использовавшийся в диагностике A. citrulli метод обогащения образца. Использование метода позволило в течение 2,5 сут. отделить образцы, в которых содержится живая целевая бактерия, от тех образцов, в которых присутствовала только ДНК A. citrulli. Успешно проведены изоляция и идентификации культуры A. citrulli из образцов после обогащения. На основании данных, полученных в результате исследований, оптимизирована схема выявления и идентификации возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli. Предлагаемая схема позволит сократить время проведения диагностики опасного карантинного организма с четырех недель до одной.

1. Bahar O. Bacterial fruit blotch: a threat to the cucurbit industry / О. Bahar, S. Burdman // Isr. J. Plant Sci. - 2010. - Vol. 58. - Pp. 19-31.

2. Boykin L.M. Tree lab: Portable genomics for early detection of plant viruses and pests in Sub-Saharan Africa / L.M. Boykin, Р. Sseruwagi, Т. Alicai, Е. Ateka, I.U. Mohammed, J.L. Stanton, С. Kayuki, D. Mark, T. Fute, J. Erasto, Н. Bachwenkizi, В. Muga, N. Mumo, J. Mwangi, P. Abidrabo, G. Okao-Okuja G. Omuut, J. Akol, Н.В. Apio, F. Osingada, М.А. Kehoe, D. Eccles, A. Savill, S. Lamb, Т. Kinene, С.В. Rawle, А. Muralidhar, К. Mayall, F. Tairo, J. Ndunguru // Genes. - 2019. - Vol. 10 (9). - № 632. - Pp. 1-13.

3. Choi O. Two genetically distinct groups of Acidovorax citrulli are present in watermelon-growing fields in Korea / О. Choi, S.K. Cho, B. Kang, J. Cho, J. Park, Y. Lee, J.J. Kim // Agric. Life Sci. - 2016. - Vol. 50. - Pp. 53-59.

4. Giovanardi D. Factors influencing the detection of Acidovorax citrulli in naturally contaminated cucurbitaceous seeds by PCR-based assays / D. Giovanardi, S.A. Sutton, E. Stefani, R.R. Walcott // Seed Sci. Technol. - 2018. - Vol. 46. - Pp. 93-106.

5. Islam M.R. Development of molecular markers for detection of Acidovorax citrulli strains causing bacterial fruit blotch disease in melon / M.R. Islam, M.R. Hossain, H.T. Kim, D.M.I. Jesse M. Abuyusuf, H.J. Jong, J.I. Park, I.S. Nou // Int. J. Mol. Sci. - 2019. - Vol. 20 (11). - № 2715. - Pp. 1-16.

6. King E.O. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin / E.O. King, M.K. Ward, D.E. Raney // Journal of Laboratory and Clinical Medicine. -1954. - Vol. 44. - Pp. 301-307.

7. Lee H. Non-destructive evaluation of bacteria-infected watermelon seeds using visible/near-infrared hyperspectral imaging. Journal of the Science of Food and Agriculture. - 2017. - Vol. 97 (4). - Pp. 1084-1092.

8. Melo L.A. Comparing Acidovorax citrulli strains from melon and watermelon: Phenotypic characteristics, pathogenicity and genetic diversity. / L.A. Melo, N.D. Tebaldi, А. Mehta, A.S.A. Marques // Trop. Plant Pathol. - 2014. - Vol. 39. - Pp. 154-162.

9. Schaad N.W. PCR primers for detection of plant pathogenic species and subspecies of Acidovorax / N.W. Schaad, W.Y. Song, E. Hatziloukas. US Patent. - 2000. - 6, 146, 834.

10. Song J.Y. Analysis of intraspecific genetic diversity in Acidovorax citrul li causing bacterial fruit blotch on cucurbits in Korea / J.Y. Song, M.M. Oo, S.Y. Park, M.W. Seo S.-C. Lee, N.B. Jeon, M.H. Nam, Y.S. Lee, H.G. Kim, S.-K. Oh // Korean J. Agric. Sci. - 2018. - Vol. 45. - Pp. 575-582.

11. Song J.Y. Genetic characteristics of Acidovorax citrulli population causing bacterial fruit blotch against cucurbits in Korea / J.Y. Song, S.Y. Park, M.W. Seo, M.H. Nam, H.S. Lim, S.-C. Lee, Y.S. Lee, H.G. Kim // Plant Dis. - 2015. - Vol. 21. - Pp. 82-88.

12. Walcott R.R. Progress towards a commercial PCR-based assay for Acidovorax avenae subsp. citrulli. Seed Sci / R.R. Walcott, A.C. Castro, А. Fessehaie, К. Ling // Technol. - 2006. - Vol. 34. - Pp. 101-116.

13. Yan L. Rapid and sensitive detection of Acidovorax citrulli in cucurbit seeds by visual loop-mediated isothermal amplification assay / L. Yan, Y. Zhao, J. Zhou, S. Chen, S. Bai, Y. Tian, W. Gong, B. Hu // Phytopathol. - 2019. - Vol. 167. - Pp. 10-18.

14. Yang R. Complete assembly of the genome of an Acidovorax citrulli strain reveals a naturally occurring plasmid in this species / R. Yang, D.S. Garcia, F. Perez Montano G.M. Silva, М. Zhao, I. Jimenez Guerrero Т. Rosenberg, G. Chen, I. Plaschkes, S. Morin, R. Walcott, S. Burdman // Front. Microbiol. - 2019. - Vol. 10, № 1400. - Pp. 1-17.

15. Каримова Е.В. Фитопатогенные бактерии Erwinia amylovora и Acidovorax citrulli и анализ их фитосанитарного риска / Е.В. Каримова, Ю.А. Шнейдер, И.П. Смирнова, Е.Н. Пакина, Т.С. Астраханова // Проблемы развития АПК региона. - 2019. - № 4 (40). - С. 71-77.

16. Лавренчук Л.С. Микробиология: Практикум / Л.С. Лавренчук, А.А. Ермошин; Под ред. Е.В. Березиной. - Екатеринбург: Изд-во Уральского унивесритета, 2019. - 107 с.

17. Словарева О.Ю. Использование методов биоинформатики в создании нового ПЦР-теста для диагностики возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli / О.Ю. Словарева, Е.В. Старикова // Сборник тезисов докладов 20-й Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти академика РАСХН Георгия Сергеевича Муромцева (г. Москва, 27-29 октября 2020 г.). - М., 2020. - С. 29-30.