Разработка ПЦР-тестов для идентификации калифорнийской щитовки Diaspidiotus perniciosus (Hemiptera: Diaspididae)

Калифорнийская щитовка Diaspidiotus (Quadraspidiotus) perniciosus (Comstock, 1881) относится к числу экономически значимых вредителей плодовых культур, регулируется Единым перечнем карантинных объектов Евразийского экономического союза. В карантинных фитосанитарных лабораториях диагностика этого вида проводится морфологическими методами, тогда как ПЦР-тесты в отношении калифорнийской щитовки не применяются. Статья посвящена разработке ПЦР-тестов для идентификации D. perniciosus на основе видоспецифичных праймеров Dp1-F/Dp1-R, которые позволяют получить ампликон размером 216 п.н., и зонда Dp1-probe для участка митохондриального гена COI. Тестирование пары праймеров и зонда in silico показало их видоспецифичность в отношении D. perniciosus. Были предложены три ПЦР-теста: 1) с электрофоретической детекцией ПЦР-продуктов; 2) в «реальном времени» с интеркалирующим красителем Sybr Green I; 3) в «реальном времени» с использованием «TaqMan» зонда. Апробация была проведена на образцах ДНК D. perniciosus и 15 видов Diaspididae, в том числе 8 видов рода Diaspidiotus. Во всех трех тестах положительный результат был зафиксирован только в случае целевого объекта, то есть показана специфичность предложенных методов идентификации. Аналитическая чувствительность каждого из трех ПЦР-тестов при испытании образцов D. perniciosus с концентрацией ДНК в диапазоне от 0,1 до 40,4 нг/мкл была равной 100%. Таким образом, ПЦР-тесты позволяют детектировать ДНК целевого объекта при ее минимальной концентрации. Разработанные ПЦР-тесты могут быть рекомендованы к применению для обеспечения карантинных фитосанитарных мер в лабораторной практике при идентификации калифорнийской щитовки, в том числе на преимагинальных стадиях. Выбор того или иного теста определяется оснащенностью лаборатории.

1. Данциг Е.М. Подотряд кокциды (Coccinea). Семейства Phoenicoccidae и Diaspididae. Фауна России и сопредельных стран: Монография. Санкт-Петербург: Наука, 1993. 449 с.

2. Об утверждении единого перечня карантинных объектов Евразийского экономического союза: решение Совета ЕЭК от 30 ноября 2016 г. № 158 URL: https://www.alta.ru/tamdoc/16sr0158/?ysclid=mb5jivfniy68790770 (дата обращения: 20.05.2025)

3. Национальный доклад о карантинном фитосанитарном состоянии территории Российской Федерации в 2024 году. URL: https://fsvps.gov.ru/files/nacionalnyj-doklad-o-karantinnom-fitosanitarnom-sostojanii-territorii-rossijskoj-federacii-v-2024-godu/ (дата обращения: 16.04.2025)

4. Amouroux P., Crochard D., Germain J., Correa M., et al. Genetic diversity of armored scales (Hemiptera: Diaspididae) and soft scales (Hemiptera: Coccidae) in Chile. Scientific Reports. 2017;7(1):1-12. https://doi.org/10.1038/s41598-017-01997-6

5. Andersen J., Wu J., Gruwell M., Gwiazdowski R., Santana S. et al. A phylogenetic analysis of armored scale insects (Hemiptera: Diaspididae), based upon nuclear, mitochondrial, and endosymbiont gene sequences. Molecular phylogenetics and evolution. 2010; 57(3): 992-1003. https://doi.org/10.1016/j.ympev.2010.05.002

6. Fita T., Getu E., Wakgari M., Woldetsadike K., Jones P. Molecular identification of white mango scale, Aulacaspis tubercularis Newstead (Homoptera: Diaspididae), and its associated natural enemies in western Ethiopia. International Journal of Tropical Insect Science. 2021;41(4):2997-3009. https://doi.org/10.1007/s42690-021-00489-5

7. Frey J., Frey B. Molecular identification of six species of scale insects (Quadraspidiotus sp.) by RAPD-PCR: assessing the field-specificity of pheromone traps. Molecular ecology. 1995;4(6):777-780. https://doi.org/10.1111/j.1365-294X.1995.tb00279.x

8. Gruwell M., Morse G., Normark B. Phylogenetic congruence of armored scale insects (Hemiptera: Diaspididae) and their primary endosymbionts from the phylum Bacteroidetes. Molecular phylogenetics and evolution. 2007;44(1):267-80. https://doi.org/10.1016/J.YMPEV.2007.01.014

9. Morse G., Normark B. A molecular phylogenetic study of armoured scale insects (Hemiptera: Diaspididae). Systematic Entomology. 2005;31(2):338-349. https://doi.org/10.1111/j.1365-3113.2005.00316.x

10. Normark B., Okusu A., Morse G., Peterson D. et al. Phylogeny and classification of armored scale insects (Hemiptera: Coccomorpha: Diaspididae). Zootaxa. 2019;4616(1):1-98. https://doi.org/10.11646/ZOOTAXA.4616.1.1

11. Schneider S., Okusu A., Normark B. Molecular phylogenetics of Aspidiotini armored scale insects (Hemiptera: Diaspididae) reveals rampant paraphyly, curious species radiations, and multiple origins of association with Melissotarsus ants (Hymenoptera: Formicidae). Molecular phylogenetics and evolution. 2018;129:291-303. https://doi.org/10.1016/j.ympev.2018.09.003

12. NCBI. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (дата обращения: 15.02.2025)

13. PM 7/129 (2) DNA barcoding as an identification tool for a number of regulated pests. EPPO Bulletin. 2021;51(1):100-143. https://doi.org/10.1111/epp.12724

14. Unipro Ugene. URL: https://ugene.net/ru/ (дата обращения: 01.02.2025)