izvestiiatimacadИзвестия Тимирязевской сельскохозяйственной академииIZVESTIYA OF TIMIRYAZEV AGRICULTURAL ACADEMY0021-342XФГБОУ ВО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева10.26897/0021-342X-2024-3-78-94izvestiiatimacad-667Research ArticleЗЕМЛЕДЕЛИЕ, РАСТЕНИЕВОДСТВО, ЗАЩИТА РАСТЕНИЙAGRONOMY, CROP PRODUCTION, PLANT PROTECTIONОпределение аналитической чувствительности и специфичности методов ПЦР для диагностики черной бактериальной пятнистости томатаDetermination of the analytical sensitivity and specificity of PCR methods for the diagnosis of bacterial spot of tomatohttps://orcid.org/0000-0002-8564-8142БелошапкинаО. О.BeloshapkinaO. O.

Белошапкина Ольга Олеговна, д-р с.-х. наук, профессор, профессор кафедры защиты растений

127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49

тел.: (499) 976–02–20

Olga O. Beloshapkina, DSc (Agr), Professor, Professor at the Department of Plant Protection

49 Timiryazevskaya St., Moscow, 127550

phone: (499) 976–02–20

beloshapkina@rgau-msha.ruhttps://orcid.org/0000-0002-3084-0591ПисареваИ. Н.PisarevaI. N.

Писарева Ирина Николаевна, научный сотрудник научно-методического отдела бактериологии

140150, Московская область, г.о. Раменский, р.п. Быково, ул. Пограничная, 32

тел.: (499) 707–22–27

Irina N. Pisareva, Researcher of Scientific and Methodological Department of Bacteriology

32 Pogranichnaya St., Bykovo, Ramensky, Moscow Oblast, 140150

iruru@yandex.ruРоссийский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. ТимирязеваРоссияRussian State Agrarian University – Moscow Timiryazev Agricultural AcademyRussian FederationВсероссийский центр карантина растенийРоссияAll-Russian Plant Quarantine CenterRussian Federation202431052024137894Copyright © Белошапкина О.О., Писарева И.Н., 20242024Белошапкина О.О., Писарева И.Н.Beloshapkina O.O., Pisareva I.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://izvestiia.timacad.ru/jour/article/view/667

Статья посвящена молекулярно-генетическим методам диагностики возбудителей черной бактериальной пятнистости томата – вредоносного бактериального заболевания томата и перца, распространенного преимущественно в открытом грунте в южных регионах. Исследования проведены на базе Всероссийского центра карантина растений (ФГБУ «ВНИИКР») в 2022–2023 гг. В задачи работы входило определение аналитической чувствительности и специфичности молекулярно-генетических методов выявления и идентификации трех видов разных патологических типов бактерий рода Xanthomonas – возбудителей черной бактериальной пятнистости томата. Ввиду необходимости импортозамещения дорогостоящих реагентов испытания проводили с отечественными реактивами производства фирм ООО «Евроген» и ЗАО «Диалат». Приведены результаты эффективности ПЦР «в реальном времени» (ПЦР-РВ), анализ которых показал, что все тестируемые праймерные системы можно рекомендовать для выявления возбудителей бактериоза. При этом установлено, что ПЦР-РВ AFLP derived Taqman PCR и XopD Taqman PCR обладают высокой аналитической чувствительностью (102–103 КОЕ/мл). Показано, что 3 из 4 праймерных систем в соответствии с методикой Koenraadt et al. (2009) также обладают высоким уровнем чувствительности –102 КОЕ/мл. Аналитическая чувствительность праймеров Bs-XpF/R для выявления X. euvesicatoria pv. perforans составила 104 КОЕ/мл, что достаточно для образцов с высокой концентрацией патогена и для идентификации чистой культуры бактерий. Все праймеры обладают 100%-ной специфичностью по отношению к целевым штаммам патогенов. Перекрестные реакции с другими штаммами не отмечены. Предлагаемая достоверная оперативная методика выявления возбудителей черной бактериальной пятнистости в семенах томата и перца в значительной степени снизит потери урожая и повысит экономическую эффективность производства отечественных овощей.

The work is devoted to molecular genetic methods for the diagnosis of pathogens of bacterial spot of tomato – a harmful bacterial disease of tomatoes and peppers, predominantly spread in the open ground in the southern regions. The research was conducted on the basis of the All- Russian Plant Quarantine Center (FGBU “VNIIKR”) in 2022–2023. The objective of the work was to determine the analytical sensitivity and specificity of molecular genetic methods for the detection and identification of three species of different pathological types of bacteria of the genus Xanthomonas – pathogens of bacterial spot of tomato. Due to the necessity of import substitution of expensive reagents, the tests were carried out with domestic reagents produced by OOO “Evrogen” and ZAO “Dialat”. The results of the effectiveness of real-time PCR (qPCR) are presented, the analysis of which showed that all tested primer systems can be recommended for the detection of bacteriosis pathogens. At the same time, qPCR AFLP derived Taqman PCR and XopD Taqman PCR were found to have high analytical sensitivity (102–103 CFU/ml). It has been shown that three out of four primer systems according to to the methodology of Koenraadt et al. (2009) also have a high sensitivity of 102 CFU/ml. The analytical sensitivity of the Bs-XpF/R primers for the detection of X. euvesicatoria pv. perforans was 104 CFU/ml, which is sufficient for samples with a high concentration of the pathogen and for the identification of a pure bacterial culture. All primers are 100% specific for the target strains of pathogens; no cross-reactions with other strains have been observed. The proposed reliable operational method for detecting pathogens of bacterial spot in tomato and pepper seeds will significantly reduce yield losses and increase the economic efficiency of domestic vegetable production.

черная бактериальная пятнистость томатаXanthomonas spp.выявление семенной инфекцииПЦР «в реальном времени»аналитическая чувствительностьспецифичность методовbacterial spot of tomatoXanthomonas spp.detection of seed infectionrealtime PCRanalytical sensitivityspecificity of the methodsИсследование выполнено в рамках Государственного задания (рег. № 122041300071–9).ReferencesOliveira-Pinto P.R., Mariz-Ponte N., Sousa R.M.O., Torres A., Tavares F., Ribeiro A., Santos C. Satureja montana essential oil, zein nanoparticles and their combination as a biocontrol strategy to reduce bacterial spot disease on tomato plants // Horticulturae. – 2021. – № 7 (12). – Pр. 1–22.Oliveira-Pinto P.R., Mariz-Ponte N., Sousa R.M.O., Torres A. et al. Satureja montana essential oil, zein nanoparticles and their combination as a biocontrol strategy to reduce bacterial spot disease on tomato plants. Horticulturae. 2021;7(12):1–22. https://doi.org/10.3390/horticulturae7120584FAO. World Food and Agriculture – Statistical Yearbook. FAO: Rome, Italy, 2024.FAO. World Food and Agriculture: Statistical Yearbook. FAO: Rome, Italy, 2024.Мотамеди Ш.А., Джалилов Ф.С.У. Влияние биопестицидов и индукторов устойчивости на развитие бактериальных болезней томата // Известия ТСХА. – 2011. – № 5. – С. 85–92.Motamedi Sh.A., Dzhalilov F.S. The effect of biopesticides and resistance inducers on the development of bacterial diseases of tomatoes. Izvestiya of Timiryazev Agricultural Academy (TAA). 2011;(5):85–92. (In Russ.)Писарева И.Н., Яремко А.Б., Приходько С.И., Шнейдер Е.Ю. Испытание тест-системы для диагностики Xanthomonas euvesicatoria pv. euvesicatoria // Фитосанитария. Карантин растений. – 2022. – № 3 (11). – С. 29–36.Pisareva I.N., Yaremko A.B., Prikhodko S.I., Shneyder E.Yu. Testing a test system for the diagnosis of Xanthomonas euvesicatoria pv. euvesicatoria. Plant Health and Quarantine. 2022;3(11):29–36. (In Russ.)EPPO. Xanthomonas spp. (Xanthomonas euvesicatoria, Xanthomonas gardneri, Xanthomonas perforans, Xanthomonas vesicatoria) causing bacterial spot of tomato and sweet pepper / Bull. OEPP. – 2013. – № 43 (1). – Pр. 7–20.Xanthomonas spp. (Xanthomonas euvesicatoria, Xanthomonas gardneri, Xanthomonas perforans, Xanthomonas vesicatoria) causing bacterial spot of tomato and sweet pepper. Bulletin OEPP EPPO Bulletin. 2013;43. URL: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/epp.12018Jones J.B., Bouzar H., Stall R.E., Almira E.C., Roberts P., Bowen B.W., Sudberry J., Strickler P., Chun J. Systematic analysis of Хanthomonads (Xanthomonas spp.) associated with pepper and tomato lesions // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. – 2000. – № 50 (3). – Pр. 1211–1219.Jones J.B., Bouzar H ., Stall R.E., Almira E.C. et al. Systematic analysis of Хanthomonads (Xanthomonas spp.) associated with pepper and tomato lesions. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2000;50(3):1211–1219. https://doi.org/10.1099/00207713-50-3-1211Vauterin L., Hoste B., Kersters K., Swings J. Reclassification of Xanthomonas // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. – 1995. – № 45 (3). – Pр. 472–489.Vauterin L., Hoste B., Kersters K ., Swings J. Reclassification of Xanthomonas. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 1995;45(3):472–489. https://doi.org/10.1099/00207713-45-3-472Jones J.B., Lacy G.H., Bouzar H., Stall R.E., Schaad N.W. Reclassification of the Xanthomonads associated with bacterial spot disease of tomato and pepper // Systematic Applied Microbiology. – 2004. – № 27 (6). – Pp. 755–762.Jones J.B., Lacy G.H., Bouzar H ., Stall R.E., Schaad N.W. Reclassification of the Xanthomonads associated with bacterial spot disease of tomato and pepper. Systematic Applied Microbiology. 2004;27(6):755–762. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.003104Bull C.T., De Boer S.H., Denny T.P., Firrao G., Fischer-Le Saux M., Saddler G.S., Scortichini M., Stead D.E., Takikawa Y. Comprehensive list of names of plant pathogenic bacteria, 1980–2007 // Journal of Plant Pathology. – 2010. – № 92 (3). – Pр. 551–592.Bull C.T., De Boer S.H., Denny T.P., Firrao G. et al. Comprehensive list of names of plant pathogenic bacteria, 1980–2007. Journal of Plant Pathology. 2010;92(3):551–592. https://doi.org/10.4454/jpp.v92i3.302Ахатов А.К. Мир томата глазами фитопатолога. – 3-е изд., испр. и доп. – М.: Товарищество научных изданий КМК, 2016. – 292 с.Akhatov A.K. World of tomatoes through a phytopathologist’ eyes. 3d ed., rev. and supp. Moscow, Russia: Tov-vo nauch. izdaniy KMK, 2016:292. (In Russ.)Иванцова Е.А. Болезни томата в Нижневолжском регионе // Фермер Поволжья. – 2017. – № 2 (55). – С. 80–82.Ivantsova E.A. Tomato diseases in the Lower Volga region. Fermer. Povolzh’eю. 2017;2(55):80–82. (In Russ.)Мотамеди Ш.А., Джалилов Ф.С.У., Карлов Г.И. Оценка активности бактерицидов с использованием генетически модифицированного штамма возбудителя черной бактериальной пятнистости томата // Известия ТСХА. – 2010. – № 2. – С. 52–58.Motamedi Sh.A., Dzhalilov F.S., Karlov G.I. Evaluation of bactericide activity using a genetically modified strain of the causative agent of bacterial spot of tomato. Izvestiya of Timiryazev Agricultural Academy (TAA). 2010;(2):52–58. (In Russ.)Fatmi M., Walcott R.R., Schaad N.V. Detection of Plant-Pathogenic Bacteria in Seed and Other Planting Material, Second Edition. – Minnesota: The American Phytopathological Society (APS), 2017. – 360 p.Fatmi M., Walcott R.R., Schaad N.V. Detection of Plant-Pathogenic Bacteria in Seed and Other Planting Material. 2d ed. Minnesota: The American Phytopathological Society (APS), 2017:360.ISF (2017) Method for the detection of Xanthomonas spp. in Tomato seed. – [Электронный ресурс]. – URL: https://seedhealth.org/files/2017/05/Pepper_Xanthomonas_spp_Version-5-Nov_2013-ISF.pdf.ISF (2017) Method for the detection of Xanthomonas spp. in Tomato seed. [Electronic source] URL: https://worldseed.org/wp-content/uploads/2022/01/2017_Protocol_Tomato_Xanthomonas_spp_v5.pdfEPPO. Xanthomonas spp. (Xanthomonas euvesicatoria pv. euvesicatoria, Xanthomonas hortorum pv. gardneri, Xanthomonas euvesicatoria pv. perforans, Xanthomonas vesicatoria) causing bacterial spot of tomato and sweet pepper // Bull. OEPP. – 2023. – № 53. – Pр. 558–579.Xanthomonas spp. (Xanthomonas euvesicatoria pv. euvesicatoria, Xanthomonas hortorum pv. gardneri, Xanthomonas euvesicatoria pv. perforans, Xanthomonas vesicatoria) causing bacterial spot of tomato and sweet pepper. EPPO Global Database. 2023;53:558–579. https://gd.eppo.int/taxon/XANTVE/documentsРебриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др. ПЦР «в реальном времени». – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. – 215 с.Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. et al. Real-time PCR. Moscow, Russia: BINOM, Laboratoriya znaniy, 2009:215. (In Russ.)Приходько С.И., Писарева И.Н., Корнев К.П. Оценка применимости молекулярных методов диагностики возбудителя бактериоза винограда (болезнь Пирса) Xylella fastidiosa Wells et al., используемых в международной и отечественной практике // Садоводство и виноградарство. – 2022. – № 1. – С. 38–43.Prikhodko S.I., Pisareva I.N., Kornev K .P. Detecting Xylella fastidiosa, a grape bacteriosis agent (Pierce disease) applicability evaluation of molecular methods used in international and domestic practice. Horticulture and Viticulture. 2022;1:38–43. (In Russ.) https://doi.org/10.31676/0235-2591-2022-1-38-43Тараканов Р.И., Игнатьева И.М., Белошапкина О.О., Чебаненко С.И., Каратаева О.Г., Джалилов Ф.С. Выявление возбудителя бактериального ожога сои Pseudomonas savastanoi pv. glycinea в семенах методом ПЦР // Известия ТСХА. – 2024. – № 1. – С. 41–52.Tarakanov R.I., Ignat’eva I.M., Beloshapkina O.O., Chebanenko S.I. et al. Detection of the soybean bacterial blight pathogen Pseudomonas savastanoi pv. glycinea in seeds by the PCR method. Izvestiya of Timiryazev Agricultural Academy (TAA). 2024;(1):41–52. (In Russ.) https://doi.org/10.26897/0021-342Х‑2024-1-41-52

The authors declare that there are no conflicts of interest present.