izvestiiatimacadИзвестия Тимирязевской сельскохозяйственной академииIZVESTIYA OF TIMIRYAZEV AGRICULTURAL ACADEMY0021-342XФГБОУ ВО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева10.26897/0021-342X-2024-4-168-183izvestiiatimacad-606Research ArticleЗООТЕХНИЯ, БИОЛОГИЯ И ВЕТЕРИНАРНАЯ МЕДИЦИНАLIVESTOCK BREEDING, BIOLOGY AND VETERINARY MEDICINEАнализ, выделение и идентификация микробиома из слепых отростков кишечника промышленных свинейAnalysis, isolation and identification of the microbiome from the ceca of the intestines of industrial pigsЛысенкоЮ. А.LysenkoYu. A.

Лысенко Юрий Андреевич, д-р биол. наук, доцент, профессор кафедры ветеринарной медицины; старший научный сотрудник отдела сопровождения грантов и НИР

27550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49

350044, г. Краснодар, ул. имени Калинина, 13,  тел.: (961) 518–07–22

Yuriy A. Lysenko, DSc (Bio), Associate Professor, Professor at the Department of Veterinary Medicine

49 Timiryazevskaya St., Moscow, 127550, phone: (961) 518–07–22

yuraduban45@mail.ruКощаевА. Г.KoshaevA. G.

Кощаев Андрей Георгиевич, д-р биол. наук, академик РАН, профессор, профессор кафедры биотехнологии, биохимии и биофизики

350044, г. Краснодар, ул. имени Калинина, 13, тел.: (989) 288–27–48

Andrey G. Koshaev, DSc (Bio), Member of the Russian Academy of Sciences, Professor, Professor at the Department of Biotechnology, Biochemistry and Biophysics

13 Kalinina St., Krasnodar, 350044, phone: (989) 288–27–48

kagbio@mail.ruБелякВ. А.BelyakV. A.

Беляк Владимир Анатольевич, аспирант кафедры биотехнологии, биохимии и биофизики

350044, г. Краснодар, ул. имени Калинина, 13, тел.: (995) 229–43–16

Vladimir A. Belyak, postgraduate student, Department of Biotechnology, Biochemistry and Biophysics

13 Kalinina St., Krasnodar, 350044, phone: (995) 229–43–16

vladimirbelyj22@yandex.ruЛуневаА. В.LunevaA. V.

Лунева Альбина Владимировна, д-р биол. наук, доцент, профессор кафедры ветеринарной медицины

27550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, тел.: (918) 417–21–38

Albina V. Luneva, DSc (Bio), Associate Professor, Professor at the Department of Veterinary Medicine

49 Timiryazevskaya St., Moscow, 127550, phone: (918) 417–21–38

albina.luneva@mail.ruМарченкоЕ. Ю.MarchenkoE. Yu.

Марченко Евгений Юрьевич, кандидат ветеринарных наук, ассистент кафедры ветеринарной медицины РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева

27550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49

Evgeniy Yu. Marchenko, CSc (Vet), Assistant at the Department of Veterinary Medicine

49 Timiryazevskaya St., Moscow, 127550, phone: (499) 977–17–82

marchenko.vet@mail.ruРоссийский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева ; Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. ТрубилинаРоссияRussian State Agrarian University – Moscow Timiryazev Agricultural Academy ; Kuban State Agrarian UniversityRussian FederationКубанский государственный аграрный университет имени И.Т. ТрубилинаРоссияKuban State Agrarian UniversityRussian FederationРоссийский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. ТимирязеваРоссияRussian State Agrarian University – Moscow Timiryazev Agricultural AcademyRussian Federation20240804202404168183Copyright © Лысенко Ю.А., Кощаев А.Г., Беляк В.А., Лунева А.В., Марченко Е.Ю., 20242024Лысенко Ю.А., Кощаев А.Г., Беляк В.А., Лунева А.В., Марченко Е.Ю.Lysenko Y.A., Koshaev A.G., Belyak V.A., Luneva A.V., Marchenko E.Y.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://izvestiia.timacad.ru/jour/article/view/606

В статье представлены данные по использованию современных методов анализа, выделению и идентификации представителей микробиоценоза слепых отростков кишечника промышленных свиней, выращиваемых по интенсивной технологии. Для изучения состава микрофлоры различных таксономических групп в химусе промышленных свиней был использован бактериальный метагеномный анализ. Для выделения доминирующих представителей рода Lactobacillus применялись классические микробиологические методы исследования. Идентификация пробиотически значимых культур микроорганизмов осуществлялась с применением масс-спектрометрического анализа на MALDI-ToF MS в спектрометре BactoSCREEN, а также дополнительно путем определения нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Проводилось полногеномное секвенирование выделенных превалирующих чистых культур рода Lactobacillus. В результате исследований установлено, что в слепых отростках кишечника поросят-сосунов, свиней на доращивании и откорме наблюдается многообразие состава микробных сообществ, которое с возрастом в количественном соотношении меняется. Результаты массспектрометрического анализа выявили наличие белковых спектров важных представителей бактерий рода Lactobacillus. Из них доминировали два вида Lactobacillus amylovorus и Limosilac-tobacillus mucosae, которые дополнительно были подтверждены путем анализа их нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК и при проведении полногеномного секвенирования.

The article presents data on the use of modern methods of analysis, isolation and identification of representatives of the microbiocenosis of the ceca of the intestines of industrial pigs raised using intensive technology. Bacterial metagenomic analysis was used to study the composition of microflora of various taxonomic groups in the chyme of industrial pigs. Classical microbiological research methods were used to isolate the dominant representatives of the genus Lactobacillus. Identification of the probiotically relevant microbial cultures was performed by mass spectrometric analysis using MALDI-ToF MS in a BactoSCREEN spectrometer, as well as by nucleotide sequencing of the 16S rRNA gene. Full-genome sequencing of isolated dominant pure cultures of the genus Lactobacillus was carried out. As a result of the research, it was found that in the cecum of the intestines of suckling piglets, growing and fattening pigs there is a diversity of microbial communities, which changes in quantitative proportions with age. The results of mass spectrometric analysis revealed the presence of protein spectra of important representatives of bacteria of the genus Lactobacillus, among which two species, Lactobacillus amylovorus and Limosilactobacillus mucosae, were dominant, which were additionally confirmed by analyzing their nucleotide sequence of the 16S rRNA gene and by performing full-genome sequencing.

микрофлора кишечникасвиньивыделениеидентификацияметагеномный анализжелудочно-кишечный трактпробиотикмасс-спектрометриялактобактериинуклеотидная последовательностьintestinal microflorapigsisolationidentificationmetagenomic analysisgastrointestinal tractprobioticmass spectrometryLactobacillusnucleotide sequenceИсследования выполнены при финансовой поддержке Кубанского научного фонда в рамках научно-инновационного проекта № НИП-20.1/22.13.ReferencesБуряко И.А. Выделение и изучение бактерий рода lactobacillus, перспективных для силосования кормов: автор. дис. … канд. биол. наук. – Минск, 1991. – 21 с.Buryako I.A. Isolation and study of bacteria of the genus Lactobacillus promising for silage of forages. PhD (Biol.) thesis abstract. Minsk, USSR, 1991: 21 (In Russ.) Isolation and selection of bacteria of the genus lactobacillus as the basis of probiotic preparations. Mezhdunarodnaya konferentsiya “Probiotiki, prebiotiki i sinbiotiki i funkcional’nye produkty pitaniya”. Moscow, Russia, 2004: 19. (In Russ.)Кощаев А.Г., Лысенко Ю.А., Мищенко В.А. и др. Интенсификация процесса культивирования физиологически адаптированных лактобацилл как основа создания биопрепаратов микробного происхождения для птицеводства // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. – 2017. – № 128. – С. 1102–1115.Koshchaev A.G., lysenko Yu.A., Mishchenko V.A. et al. Intensification of the process of cultivation of physiologically-adapted lactobacillus as a basis for the creation of biopreparations of microbial origin for poultry farming. Polythematic online Scientific Journal of Kuban State Agrarian University. 2017;128:1102–1115. (In Russ.)Клименко Е.С., Погодина А.В., Рычкова Л.В., Белькова Н.Л. Возможность таксономической идентификации бифидобактерий на основании различных вариабельных районов гена 16S рРНК // Генетика. – 2020. – Т. 56, № 8. – С. 904–914.Klimenko E.S., Pogodina A.V., Rychkova l.V., Bel’kova N.l. The ability of taxonomic identification of bifidobacteria based on the variable regions of 16S rRNA gene. Genetika. 2020;56(8):904–914. (In Russ.)Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований: учебник. – М.: Медицина. ‒ 1978. – 394 с.Labinskaya A.S. Microbiology with microbiological research techniques. Moscow, Russia: Meditsina. 1978:394. (In Russ.)Локачук М.Н., Фролова Ю.М. Видовая идентификация чистых культур заквасочных микроорганизмов // Пищевые системы. – 2021. – Т. 4, № 3S. – С. 184–187.Lokachuk M.N., Frolova Yu.M. Species identification of lactobacilli for the sourdough. Food Systems. 2021;4(3S):184–187. (In Russ.)Бойко А.А., Кощаев А.Г., Лысенко Ю.А. и др. Мясная продуктивность цыплят-бройлеров в зависимости от условий содержания и кормления при использовании в рационе микробной добавки // Ветеринария и кормление. – 2022. – № 3. – С. 8–11.Boyko A.A., koshchaev A.G., lysenko Yu.A. et al. Meat productivity of broiler chickens depending on the conditions of keeping and feeding when using microbial additives in the diet. Veterinariya i kormlenie. 2022;3:8–11. (In Russ.)Устинова В.В., Смирнова Т.Г., Варламов Д.А. и др. Полногеномное секвенирование генома Mycobacterium heckeshornense // Бактериология. – 2017. – Т. 2, № 3. – С. 108–109.Ustinova V.V., Smirnova T.G., Varlamov D.A. et al. Full genome sequencing of the genome of Mycobacterium heckeshornense. Bacteriology. 2017;2(3):108–109. (In Russ.)Попов Д.А., Овсеенко С.Т., Вострикова Т.Ю. Применение метода MAlDI-TOF MS в современной микробиологической лаборатории // Поликлиника. – 2016. – № 1–3. – С. 53–56.Popov D.A., Ovseenko S.T., Vostrikova T.Yu. Application of MAlDI-TOF MS method in a modern microbiological laboratory. Poliklinika. 2016;1–3:53–56. (In Russ.)Кощаев А.Г., Фисенко Г.В., Лысенко Ю.А. и др. Продуктивность и мясные качества перепелов при использовании пробиотической кормовой добавки // Аграрная наука. – 2015. – № 11. – С. 15–18.Koshchaev A.G., Fisenko G.V., lysenko Yu.A. et al. Productivity and meat quality of quails at use probiotic feed additive. Agrarian Science. 2015;11:15–18. (In Russ.)Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2019618111. Программа для идентификации микроорганизмов BactoSCREEN-ID:№ 2019616938. Заяв. 14.06.2019; Опубл. 26.06.2019. Заявитель: Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственная фирма «Литех».Certificate of state registration of computer program No. 2019618111. Program for identification of microorganisms BactoSCREEN-ID: No. 2019616938: applied on 14.06.2019: published on 26.06.2019. llC Scientific and Production Firm “litech”. (In Russ.)Соловьева В.В., Григорьева Т.В., Ризванов А.А. Идентификация микроорганизмов с помощью молекулярно-генетического анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рибосомной РНК: Методическое пособие. – Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет, 2011. – 44 с.Solov’eva V.V., Grigor’eva T.V., Rizvanov A.A. Identification of microorganisms using molecular genetic analysis of the nucleotide sequence of the 16S ribosomal RNA gene: methodical manual. kazan, Russia: kazan Federal University, 2011:44. (In Russ.)Радченко В.В., Ильницкая Е.В., Шуваева Т.М. и др. Сравнительный анализ и пробиотический потенциал новых штаммов рода Lactobacillus из эволюционно закрепленных микробных ассоциаций желудочно-кишечного тракта дикой птицы // Биофармацевтический журнал. – 2020. – Т. 12, № 1. – С. 25–30.Radchenko V.V., Ilnitskaya E.V., Shuvaeva T.M. et al. A comparative analysis of the probiotic potential of new strains of the genus lactobacillus of the evolutionary fixed microbial associations of the gastrointestinal tract of wild birds. Biofarmatsevticheskiy zhurnal. 2020;12(1):25–30. (In Russ.)Турова Т.П. Применение методов геносистематики для решения вопросов таксономии и изучения биоразнообразия прокариот: Автореф. дис. … д-ра биол. наук. – Москва, 2009. – 86 с.Turova T.P. Application of genosystematics methods to address taxonomy and biodiversity of prokaryotes. DSc (Bio) thesis: 03.00.07. Moscow, Russia, 2009:86. (In Russ.)Васильев Д.А., Феоктистова Н.А., Мастиленко А.В. и др. Установление видовой принадлежности штаммов энтеробактерий методом MAlDI-TOF MS // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. – 2018. – № 2 (42). – С. 110–113.Vasiliev D.A., Feoktistova N.A., Mastilenko A.V. et al. Species identification of enterobacteria strains by means of MAlDI-TOF MS. Vestnik Ul’yanovskoj gosudarstvennoj sel’skohozyajstvennoj akademii. 2018;2(42):110–113. (In Russ.)Кощаев А.Г., Лысенко Ю.А., Радченко В.В. и др. Эффективность использования пробиотической добавки трилактокор в рационе перепелов // Аграрный вестник Урала. – 2017. – № 8 (162). – С. 4.Koshchaev A.G., lysenko Yu.A., Radchenko V.V. et al. Efficiency of using probiotic additive trilactocor in the diet of quails. Agrarian Bulletin of the Urals. 2017;8(162):4. (In Russ.)Bankevich А., Nurk S., Antipov D. et al. A new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing // SPAdes: J. Comp. Biol. ‒ 2012. ‒ Vol. 19 (5). ‒ Pр. 455–477.Bankevich A., Nurk S., Antipov D. et al. A new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. SPAdes: J. Comp. Biol. 2012;19(5):455–477.Zhang J., Chen x., Liu P. et al. Dietary clostridium butyricum induces a phased shift in fecal microbiota structure and increases the acetic acid-producing bacteria in a weaned piglet model // J. Agric Food Chem. – 2018. – № 66. – Рр. 515–66.Zhang J., Chen X., liu P. et al. Dietary clostridium butyricum induces a phased shift in fecal microbiota structure and increases the acetic acid-producing bacteria in a weaned piglet model. J. Agric. Food Chem. 2018;66:5157–66.Wu J., Zhao Y., Wang x. et al. Dietary nutrients shape gut microbes and intestinal mucosa via epigenetic modifications // Critic Rev Food Sci Nutri. – 2020. – 20:1–15.Wu J., Zhao Y., Wang X. et al. Dietary nutrients shape gut microbes and intestinal mucosa via epigenetic modifications. Critic Rev. Food Sci. Nutri. 2020;20:11–5.Auch A.F. et al. Digital DNA-DNA hybridization for microbial species delineation by means of genome-to-genome sequence comparison // Standards in genomic sciences. – 2010. – Vol. 2. – Pр. 117–134.Auch A.F. et al. Digital DNA-DNA hybridization for microbial species delineation by means of genome-to-genome sequence comparison. Standards in Genomic Sciences. 2010;2:117–134.Vemuri R., Gundamaraju R., Shinde T. et al. Lactobacillus acidophilus Dds-1 modulates intestinal-specific microbiota, short-chain fatty acid and immunological profiles in aging mice // Nutrients. – 2019. – 11:6.Vemuri R., Gundamaraju R., Shinde T. et al. lactobacillus acidophilus Dds-1 modulates intestinal-specific microbiota, short-chain fatty acid and immunological profiles in aging mice. Nutrients. 2019;11:6.Meier-Kolthoff J.P., Goker М. TYGS is an automated high-throughput platform for state-of-the-art genome-based taxonomy // Nature communications. – 2019. – Vol. 10, № 1. – 2182 p.Meier-kolthoff J.P., Goker M. TYGS is an automated high-throughput platform for state-of-the-art genome-based taxonomy. Nature Communications. 2019;10(1):2182.Gurevich A. et al. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies // Bioinformatics. – 2013. – Vol. 29, № 8. – Pр. 1072–1075.Gurevich A. et al. QUAST: quality assessment tool for genome assemblies. Bioinformatics. 2013;29(8):1072–1075.Kim E.Y., Kim Y.H., Rhee M.H. et al. Selection of Lactobacillus sp. Psc101 that produces active dietary enzymes such as amylase, lipase, phytase and protease in pigs // J. Gene Appl Microbiol. – 2007. – Vol. 53. – 111:7.Kim E.Y., kim Y.h., Rhee M.h. et al. Selection of lactobacillus sp. Psc101 that produces active dietary enzymes such as amylase, lipase, phytase and protease in pigs. Gene Appl. Microbiol. 2007;53:111–7.Sondheimer N., Lindquist S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast // Mol Cell. – 2000. – № 5. – Рр. 163–72.Sondheimer N., lindquist S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol. Cell. 2000;5:163–72.Tahimic C.G., Wang Y., Bikle D.D. Anabolic effects of Igf-1 signaling on the skeleton // Front Endocrinol. – 2013. – 4:6.Tahimic C.G., Wang Y., Bikle D.D. Anabolic effects of Igf-1 signaling on the skeleton. Front Endocrinol. 2013;4:6.Tatusova Т., DiCuccio М., Badretdin А. et al. NCBI prokaryotic genome annotation pipeline // Nucleic acids research. – 2016 – Vol. 44, № 14. – Pр. 6614–6624.Tatusova T., DiCuccio M., Badretdin A. et al. NCBI prokaryotic genome annotation pipeline. Nucleic Acids Research. 2016;44(14):6614–6624.Okonechnikov K. et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit // Bioinformatics. – 2012. – V. 28, № 8. – Pр. 1166–1167.Okonechnikov k. et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012;28(8):1166–1167.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.