Андрей Владимирович Шипулин, научный сотрудник лаборатории экологии и генетики насекомых и клещей
140150, Московская область, г.о. Раменское, р.п. Быково, ул. Пограничная, 32, тел.: 8-925-404-40-93
Andrey V. Shipulin, Research Associate at the Laboratory of the Ecology and Genetics of Insects and Mites
32 Pogranichnaya St., Bykovo, Ramenskoe, Moscow Region, 140150
Калифорнийская щитовка Diaspidiotus (Quadraspidiotus) perniciosus (Comstock, 1881) относится к числу экономически значимых вредителей плодовых культур, регулируется Единым перечнем карантинных объектов Евразийского экономического союза. В карантинных фитосанитарных лабораториях диагностика этого вида проводится морфологическими методами, тогда как ПЦР-тесты в отношении калифорнийской щитовки не применяются. Статья посвящена разработке ПЦР-тестов для идентификации D. perniciosus на основе видоспецифичных праймеров Dp1-F/Dp1-R, которые позволяют получить ампликон размером 216 п.н., и зонда Dp1-probe для участка митохондриального гена COI. Тестирование пары праймеров и зонда in silico показало их видоспецифичность в отношении D. perniciosus. Были предложены три ПЦР-теста: 1) с электрофоретической детекцией ПЦР-продуктов; 2) в «реальном времени» с интеркалирующим красителем Sybr Green I; 3) в «реальном времени» с использованием «TaqMan» зонда. Апробация была проведена на образцах ДНК D. perniciosus и 15 видов Diaspididae, в том числе 8 видов рода Diaspidiotus. Во всех трех тестах положительный результат был зафиксирован только в случае целевого объекта, то есть показана специфичность предложенных методов идентификации. Аналитическая чувствительность каждого из трех ПЦР-тестов при испытании образцов D. perniciosus с концентрацией ДНК в диапазоне от 0,1 до 40,4 нг/мкл была равной 100%. Таким образом, ПЦР-тесты позволяют детектировать ДНК целевого объекта при ее минимальной концентрации. Разработанные ПЦР-тесты могут быть рекомендованы к применению для обеспечения карантинных фитосанитарных мер в лабораторной практике при идентификации калифорнийской щитовки, в том числе на преимагинальных стадиях. Выбор того или иного теста определяется оснащенностью лаборатории.
The San Jose scale, Diaspidiotus (Quadraspidiotus) perniciosus (Comstock, 1881), is a significant economic pest of fruit crops regulated under the Common List of Quarantine Pests of the Eurasian Economic Union. In quarantine phytosanitary laboratories, diagnosis of this species is typically performed using morphological methods; PCR teats for D. perniciosus are not routinely employed. This article describes the development of PCR tests for the identification of D. perniciosus based on speciesspecific primers Dp1-F/Dp1-R, which amplify a 216 bp amplicon, and a Dp1-probe targeting a region of the mitochondrial COI gene. In silico testing of the primer pair and probe demonstrated their species specificity for D. perniciosus. Three PCR tests were developed: 1) with electrophoretic detection of PCR products; 2) a real-time PCR with the intercalating dye Sybr Green I; and 3) a real-time PCR using a TaqMan probe. They were tested on DNA samples of D. perniciosus and 15 other Diaspididae species, including eight species of the genus Diaspidiotus. In all three tests, a positive result was only obtained for the target species, demonstrating the specificity of the proposed identification methods. The analytical sensitivity of each of the three PCR tests, when tested on D. perniciosus DNA samples with concentrations ranging from 0.1 to 40.4 ng/μL, was 100%, indicating that the PCR tests can detect the target DNA at its minimum concentration. The developed PCR tests can be recommended for use in quarantine phytosanitary measures in laboratory practice for the identification of D. perniciosus, including at pre-imaginal stages; the choice of a test depends on the available laboratory equipment.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.